上海信帆生物：從互作揭開lncRNA的秘密

RNA結合蛋白免疫沉淀技術又稱為RIP（RNA immunoprecipitation），可以說是RNA版的ChIP（染色質免疫沉淀），該技術能幫助人們分析與RNA結合蛋白相關的核酸。

在RIP試劑盒（如Sigma的Imprint® RNA Immunoprecipitation kit）的幫助下，研究者們能夠利用針對RNA結合蛋白的抗體，從細胞提取物中捕獲與蛋白相結合的RNA，再通過qPCR、芯片或二代測序技術對這些RNA進行鑒定。

不論是細胞質還是細胞核，都會發生RNA與蛋白的相互作用。據Active Motif公司產品Kyle Hondorp介紹，該公司的RNA ChIP-IT® kit于研究RNA與細胞核染色質的相互作用。該試劑盒通過甲醛固定來鎖定RNA-染色質的互作，隨后對染色質進行超聲，并用DNAse I處理，zui后利用磁珠進行沉淀。

“如你研究的是總mRNA，那么常規RIP試劑盒更合適一些，”Hondorp說，“常規RIP試劑盒可以處理所有細胞裂解物的總mRNA。”

生物試劑Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在開發專門針對染色質的RIP試劑盒。預計這一新產品將于2014年*季度發布，該產品有化學交聯與native兩種形式。據介紹，化學交聯可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白復合物。而native方法展現的是，親和力更高也更為直接的相互作用。

除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以幫助人們捕捉與RNA結合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯與核酸酶消化，不僅允許對RNA-蛋白復合物進行進一步的純化（如凝膠電泳片段分離），還能夠揭示RNA-蛋白互作所發生的位點。zui近人們又開發出了新型CLIP 技術——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），該技術能夠以單個堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細信息。

據倫敦大學學院的Jernej Ule教授介紹，CLIP與RIP的關鍵性差異，在于沉淀復合物后的凝膠純化步驟。CLIP技術可以給RNA-蛋白復合物的RNA末端帶上放射性標記，并將這些復合物進行SDS-PAGE分離，之后轉移到一張膜上。這樣的過程可以提高純化的特異性，減少非特異性的RNA。蛋白酶消化可以將RNA從膜上解離下來，用于制備cDNA文庫，以備測序分析。

“CLIP要比RIP麻煩一些，不過我認為它很值得采用，”Ule說。“放射性信號的量及其特異性，能夠幫助我們提高cDNA文庫的質量，zui終得到準確實用的數據。”

ChIRP、CHART和RAP

如果你對某種RNA感興趣，希望研究與其發生相互作用的蛋白，就需要采用新的實驗方案。ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）都基于同樣的理念，將與目標RNA互補的寡核苷酸進行生物素標記，并由此捕獲相關蛋白。之后研究者可以通過二代測序或質譜分析，來鑒定與RNA互作的蛋白，明確發生這些互作的基因組區域。

據NEB的G. Brett Robb介紹，上述三種方法解決了當今RNA生物學中的關鍵需求。目前，研究者們已經鑒定了大量的lncRNA，但卻不清楚它們的功能。“解決這一問題的途徑之一，就是尋找與這些RNA發生互作的蛋白。”舉例來說，加州理工學院的Mitchell Guttman和賓州大學的Jeannie Lee，就分別在使用RAP和CHART對Xist lncRNA展開研究。

據悉，目前ChIRP、CHART和RAP技術都還沒有商業化。不過有一個試劑盒可以實現從已知RNA分離蛋白，即MBL International的RiboTrap系統，該系統能夠利用體外轉錄的RNA（帶生物素標記），從細胞提取物中分離與之結合的蛋白。

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