免疫組織可以走捷徑？IHC 優(yōu)化下貼士

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免疫組化（IHC）的原理是，根據(jù)抗體與抗原的特異結(jié)合來(lái)檢測(cè)組織切片中的抗原（如蛋白）。詞根immuno是指操作中所使用的抗體，而histo代表著組織。

利用特異的腫瘤標(biāo)志物，醫(yī)生們可以通過(guò)IHC診斷腫瘤是良性還是惡性，確定腫瘤的分期和分級(jí)，鑒別細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)移的來(lái)源。IHC也能用于藥物開(kāi)發(fā)，研究者們通過(guò)檢測(cè)靶點(diǎn)的上調(diào)或下調(diào)來(lái)判斷藥物的療效。

商業(yè)化的IHC抗體一般都提供有稀釋和染色的建議，能為你節(jié)省許多摸索過(guò)程。然而，事情往往沒(méi)那么簡(jiǎn)單。你的抗體可能沒(méi)在IHC中驗(yàn)證過(guò)，或者你的樣本并不標(biāo)準(zhǔn)，又或者實(shí)驗(yàn)就是不像文獻(xiàn)或演示視頻那樣順利，這時(shí)我們?cè)撛趺崔k呢？

“IHC不只與一抗有關(guān)，還有緩沖液、抗原修復(fù)液和酶，”紐約大學(xué)Langone醫(yī)學(xué)中心的IHC主管Luis Chiriboga說(shuō)，“這些都是重要的變量。”平衡這些變量是一件相當(dāng)繁瑣事，而本文介紹的一些小竅門(mén)可以幫你簡(jiǎn)化這一過(guò)程。

首先要有信號(hào)

Chiriboga在教學(xué)生做IHC時(shí)總會(huì)說(shuō)，生成信號(hào)是*要?jiǎng)?wù)。“你必須先看到信號(hào)，才知道接下來(lái)要怎么做。” 一開(kāi)始他通常使用較高的抗體濃度，在抗原表達(dá)水平不同的組織中進(jìn)行測(cè)試，以便獲得一個(gè)動(dòng)態(tài)范圍。

不過(guò)，調(diào)整信號(hào)就不只是抗體的問(wèn)題了。“高品質(zhì)抗體是*要素。但如果用錯(cuò)了其它試劑，好抗體也會(huì)失敗，”CST公司的Katherine Crosby說(shuō)。

緩沖系統(tǒng)對(duì)一抗結(jié)合抗原的能力有著深遠(yuǎn)的影響。如果你用了抗體供應(yīng)商推薦的試劑和方案但卻沒(méi)有看到理想的結(jié)果，就應(yīng)該及時(shí)供應(yīng)商的。如果你用的是經(jīng)未測(cè)試的抗體，就有必要對(duì)pH或離子強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

如果實(shí)驗(yàn)仍然檢測(cè)不到組織里的抗原，但該抗原的確有表達(dá)，那么可能是抗原表位在固定過(guò)程中出了問(wèn)題（比如被掩蓋或變性）。在這種情況下，我們就需要對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)。目前的抗原修復(fù)基本上是酶處理（比如pronase或trypsin）或者某種形式的加熱，Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson說(shuō)。

另外，我們還可以嘗試不同的固定劑，用乙醇、甲醇甚至丙酮來(lái)取代福爾馬林。“這些試劑會(huì)使抗原表位產(chǎn)生不同的改變，”Stephenson指出。

更好的標(biāo)記體系

一般情況下，抗原識(shí)別只是整個(gè)過(guò)程的一部分。經(jīng)典IHC方案是用二抗來(lái)識(shí)別一抗。二抗可以與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）直接相連，不過(guò)更多情況是先用二抗連接生物素，然后用連有酶的鏈霉親和素來(lái)進(jìn)行識(shí)別。這樣能形成一個(gè)多層次的信號(hào)放大系統(tǒng)。

“不過(guò)，這樣的系統(tǒng)也可能帶來(lái)更多的誤差和背景，”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin說(shuō)。舉例來(lái)說(shuō)，親和素可能識(shí)別內(nèi)源生物素，尤其是在肝臟和腎臟這樣的組織。（延伸閱讀：攻克多重PCR之難）

為此，許多研究者放棄了偶聯(lián)生物素的二抗，開(kāi)始使用一種以聚合物為基礎(chǔ)的試劑。“它們相當(dāng)于拖著一長(zhǎng)串酶的二抗，”Vector Laboratories公司的Craig Pow說(shuō)，該公司致力于生物試劑蛋白標(biāo)記和檢測(cè)試劑。“這顯然比使用HRP二抗要靈敏得多。”

據(jù)Pow介紹，這種試劑的敏感度與生物素/親和素差不多，但使用起來(lái)要簡(jiǎn)單得多，而且不用擔(dān)心內(nèi)源生物素產(chǎn)生的背景。如果需要更高的敏感度，還可以采用基于多級(jí)聚合物的試劑，比如Vector Laboratorieszui近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit。

與酶體系相比，熒光體系能夠更的定位抗體，甚至可以同時(shí)成像兩個(gè)核抗原。不過(guò)，熒光成像的黑色背景不能提供常規(guī)顯微鏡那樣的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。Sigma Aldrich公司的Duolink®系統(tǒng)有足夠的敏感性和特異性，可以通過(guò)兩個(gè)一抗檢測(cè)鄰近的抗原表位。

選擇合適的顏色

IHC中zui常用的酶是HRP和堿性磷酸酶（AP），不過(guò)它們的效果并非*相同。HRP體系傾向于生成更密集的信號(hào)，“與AP相比能提供更細(xì)小更清晰的定位，”Pow說(shuō)。但這并不是說(shuō)AP就比HRP差，“實(shí)際上在某些應(yīng)用中，正因?yàn)锳P不那么稠密，反而能展現(xiàn)出更好的形態(tài)。”

這兩種酶都有不同的生色底物，可以產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。“我們應(yīng)當(dāng)選擇合適的顏色和復(fù)染劑，”Crosby說(shuō)。

IHC遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是把抗體放在組織切片上，然后用顯微鏡觀察那么簡(jiǎn)單。要想得到實(shí)用、可靠而且清晰的結(jié)果，就需要耐心的對(duì)每一步進(jìn)行優(yōu)化。

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