信帆生物：游離脂肪酸（NEFA）檢測試劑盒的正確使用方法

信帆生物：游離脂肪酸（NEFA）檢測試劑盒的正確使用方法

一、測定原理：

游離脂肪酸（NEFA）能與銅離子結合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比。用銅試劑測定其中銅離子的含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。

二、試劑組成與配制（50管/48樣）：

試劑一：氯--仿（分析純），自備。

試劑二：緩沖液，40mL×1瓶，室溫保存6個月。

試劑三：銅試劑，甲液30mL×1瓶，乙液 30mL×1瓶，丙液 5mL×1瓶，4℃保存6個月。試劑三銅試劑的配制：按甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1的比例進行配制，需多少配多少，配好后4℃可保存二周。

試劑四：顯色劑，粉劑×2支，稀釋液10mL×2瓶，4℃保存3個月。試劑四顯色劑的配制：臨用時將1支粉劑溶解于1瓶10mL稀釋液中，配好后4℃可保存二周。

試劑五：棕櫚酸標準品粉劑×2支，溶劑50mL×1瓶，4℃保存3個月。1000µmol/L棕櫚酸標準品的配制：將一支粉劑用溶劑溶解后定容至20mL（注意用溶劑將裝粉劑的小離心管洗凈）。

試劑六：雙蒸水40mL×1瓶（做空白管用）。

三、操作步驟：

1、分別取玻璃試管進行編號（最好用帶蓋的磨口試管進行實驗，防止試劑揮發及更好的抽提）。

2、操作表：

[注]：詳細操作步驟：

1、充分混勻準確抽提2分鐘（用秒表計時）。如果您沒有磨口試管，可用普通玻璃試管代替，但必須用保鮮薄膜封口，以便防止液體揮發及濺出。

2、抽提完后以3500轉/分離心10分鐘，若發現下層液體呈半凝固狀態、凝固層較厚或下層液體不足2mL時，則可用小玻棒或移液器吸嘴輕輕攪拌后再次離心，直至分層清楚。

3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉針套吸取上層液體及凝固層并棄之。

4、另取一個注射器及硬膜外麻醉針心針套，將硬膜外麻醉針心插入針套中，小心插入下層抽提液中，拔出針心，接上注射器，吸取下層抽提液2.3～2.5mL至另一試管中。（這樣可避免上層液體及凝固層混入下層液體中，若混入上層液體及凝固層，則需重新離心后再取下層抽提液，否則會影響結果。）若偶然發現抽提液有霧狀混濁，可放入37℃水浴1～2分鐘即可。

5、再從上述試管中準確吸取2mL下層抽提液加入另一試管中，加顯色劑進行顯色。

6、比色皿在用雙蒸水沖洗干凈后，還必須用無水乙醇沖洗，然后加三氯--甲-調零，否則加入的三氯--甲-中會混有水珠（三氯--和水不互溶）。

7、操作工程中最好用玻璃管，某些材質的塑料離心管也可使用（用加入三氯---烷的方法驗證是否可用）。

以上七點為實驗成敗的關鍵。硬膜外麻醉針本所有售。

四、計算公式及舉例：

1、血清計算公式及舉例：

①、公式：見說明書

②、計算舉例：

取某人血清0.2mL按操作表進行游離脂肪酸測定。測得各管吸光度如下：空白管為0.045，標準管為0.311，測定管為0.159。則計算如下：

   2、組織樣本計算公式及舉例：

①、公式：見說明書

Cpr：組織樣本蛋白濃度，gprot/L（prot指蛋白）。

注：非蛋白樣可以將樣本質量濃度替換蛋白濃度代入計算。

②、計算舉例：見說明書

取大鼠10%肝組織勻漿上清液0.2mL按操作表進行游離脂肪酸測定。測得各管吸光度如下：空白管為0.045，標準管為0.311，測定管為0.293。10%肝組織中蛋白濃度為12.24g/L，則計算結果如下：

五、注意點：

1、實驗必須用分光光度計比色，不可用酶標儀、半自動及全自動生化分析儀比色（有機溶劑對這些儀器會有損壞）。

2、顯色前吸取下層抽提液時，吸管不要觸及管壁，以免沾染管壁上粘著的銅試劑。下層抽提液必須清澈，否則會使結果偏高。

3、膽紅素可被試劑一抽提而干擾比色，故黃疸血清須做一對照管，即最后不加顯色劑而用正丁醇代替，在測定管光密度讀數中減去此對照管的光密度讀數。